Lon蛋白酶是一种高度保守的AAA+蛋白酶，存在于细菌、古菌和真核细胞器中。它在蛋白质降解、蛋白质质量控制、粒线体基因表达、应激响应以及其他细胞事件中都扮演着重要的角色。研究表明Lon与致病细菌毒力和肿瘤发生发展密切相关，已成为近年来抗菌和抗癌策略的新靶标。

Lon的单体具有3个结构域（N端结构域、AAA+域和蛋白酶域），它通过形成同源六聚体行驶功能。Lon的蛋白水解活性位点位于六聚体的中空腔室中，底物只能通过狭窄的轴向孔进入。张凯铭/李珊珊团队近年来一直致力于Lon蛋白酶的结构和功能研究，阐明了其N端结构域如何识别底物并使底物去折叠（Sci Adv. 2021a）、ATP酶结构域如何促使底物易位将其送入桶状降解室（J Biol Chem. 2021）、底物在降解室里如何被水解并作为肽产物释放（Sci Adv. 2021b）。然而， Lon功能性六聚体的组装过程仍然未知。

2023年11月13日，中国科学技术大学张凯铭/李珊珊团队和台北中央研究院张崇毅团队合作在Nature communications杂志发表题为 “A 5+1 assemble-to-activate mechanism of the Lon proteolytic machine”的文章。这项新的研究展示了Lon AAA+蛋白酶的激活过程，包括五聚体组装和依赖底物的第六个单体插入形成激活态。

在本次工作中，中科大副研究员李珊珊等人解析了一系列从无底物状态到底物结合状态的Lon结构，这些结构使得研究人员能够识别和观察不同的组装中间体中每个单体的结构变化。研究揭示了Lon蛋白酶的螺旋性五聚体的重要作用：在没有底物的情况下，第六个单体会结合到螺旋五聚体的最低位置，形成具有受阻孔环的自抑制螺旋六聚体。然而，当底物存在时，第6个单体的结合会形成闭合环六聚体，这反过来又打开了蛋白水解槽。因此，在Lon蛋白酶的组装过程中，五聚体与第6个单体底物依赖性的结合，激活了众所周知的底物-孔环接触的形成，最终形成了功能性六聚体（图1）。

 图1. Lon蛋白酶的“5+1”组装-激活机制。

为了验证这一“5+1”激活模型，研究人员构建了Lon的单体突变体（N-E613K和N-L708R），这些单体突变体可以与五聚体形式结合形成螺旋性六聚体而无法形成功能性六聚体，以浓度依赖的方式完全抑制野生型Lon对底物的降解。这些结果表明，螺旋五聚体，而不是螺旋六聚体，是介导Lon底物依赖性激活的关键介质（图2）。进一步的研究表明，这些突变体在大肠杆菌细胞中的表达，导致了与Lon缺乏相关的特定表型变化，包括抑制持久性细胞的形成（图3）。因此，通过一系列体外和体内实验，研究人员证明了这种“5+1” 组装-激活机制的功能和生物学意义。

图2. Lon的单体突变体结合到五聚体形式并有效抑制Lon的活性。

Fig. 3. 大肠杆菌细胞中单体突变体的表达引发一系列与Lon deficiency相关的表型。

综上，这些研究发现为AAA+蛋白酶的激活机制提供了一个新的范例，该激活机制是由底物控制的组装过程诱导的，其中五聚体的中间状态在组装过程中起着至关重要的作用。这项研究强调了细胞内蛋白水解机器是如何受到底物存在的严格控制的，如果不受控制，它将具有潜在的破坏性。最后，这项工作还展示了一种抑制细胞内特定AAA+蛋白的新策略，从而阻碍大肠杆菌持久性细胞的形成。这些结果可能为靶向抑制细胞中特定 AAA+ 蛋白的治疗应用开辟新途径。

 该研究工作获得了细胞动力学教育部重点实验室、国家自然科学基金委、科技部、中国科学院先导等项目的资助，以及获得了中国科大冷冻电镜中心及附一院的大力支持。中国科学技术大学为该工作的第一完成单位，生命科学与医学部李珊珊副研究员和台北中央研究院博士后谢侃言为共同第一作者。李珊珊副研究员、张凯铭教授及张崇毅研究员为共同通讯作者。