催化反应过程中，许多反应中间体自由基、参与催化反应金属催化剂的价态变化、氧化还原过程中的电子传递过程等，都能应用电子自旋共振（Electron Paramagnetic Resonance, EPR）方法进行鉴定和分析。长期以来，中国科学技术大学生命学院田长麟教授团队在中科院强磁场科学中心开展了高场EPR设备搭建、低温EPR方法发展、化学催化与生物酶催化机制研究中自由基鉴定与电子传递分析等研究工作，并取得了系列合作研究成果 (Nat Catalysis 2023; Angew Chem Int Ed 2023, PNAS, 2023, 2022; ACS Catalysis 2023, 2021; Chem Commun, 2022, 2021; Science 2018等) 。近期，田长麟教授团队与南京大学黄小强团队及梁勇团队合作，在光酶催化研究领域取得重要进展，针对团队首创的焦磷酸硫胺素（ThDP）依赖酶和光催化协同的双催化新体系，应用EPR方法鉴定了该催化反应新体系中的自由基中间体及催化反应中的电子转移机制，研究成果以“A light-driven enzymatic enantioselective radical acylation”为题，2023年12月18日在线发表于Nature上。

生物制造是变革工业可持续发展最有希望的绿色技术之一，也是合成生物学中酶催化的核心。酶催化与光催化结合的光酶催化，融合了光化学多样的反应性和酶的高选择性，成为开发新酶功能最前沿的策略。合作研究团队综合利用仿生和化学模拟的思路（图1），借助可见光激发和定向进化手段，在将酶的催化功能扩展至自由基-自由基交叉偶联，从而将ThDP依赖的苯甲醛裂解酶“重塑”为自由基酰基转移酶（RAT），实现了一例非天然的高对映选择性的自由基-自由基偶联反应。

图1：融合化学与生物，开发新生物合成体系

合作团队以4-甲氧基苯甲醛1a和自由基前体氧化还原活性酯2a作为模板底物，探索了有机染料曙红Y和ThDP依赖酶的催化体系。随后通过分子动力学模拟和半理性设计构建了小而精的突变体库，获取最优突变体酶，实现了高底物耐受性，高底物选择性（对映选择性最高达97% ee），凸显了酶可调的活性口袋对于游离自由基立体化学的精妙调控作用（图2）。

图2：模板反应和底物谱扩展

针对该光酶双催化体系，田长麟教授团队应用低温（80K）电子顺磁共振（EPR）实验，捕获到了由ThDP所衍生的ketyl自由基（Int. B）；通过EPR自旋捕获（spin trapping）实验在标准反应体系中检测到了特征的六重裂分谱图，证实其为中间体benzylic radical（Int. C）与捕获剂加成后的自由基产物，为揭示了新酶反应性的关键提供了直接证据。

图3：机理推测与基于EPR方法的机理探究

研究团队合作开发了结合ThDP依赖酶催化和有机光敏剂Eosin Y催化的双催化体系，将苯甲醛裂解酶改造为光驱动的自由基酰基转移酶，不仅突破了天然酶催化功能，还实现了手性氮杂环卡宾难以实现的前手性自由基的优异立体化学控制。

上述研究工作得到了国家自然科学基金委杰出青年基金、重大仪器研制项目、科技部重点研发计划等资助。

原文链接：A light-driven enzymatic enantioselective radical acylation

Yuanyuan Xu^#, Hongwei Chen^#, Lu Yu^#, Xichao Peng, Jiawei Zhang, Zhongqiu Xing, Yuyan Bao, Aokun Liu, Yue Zhao, Changlin Tian*, Yong Liang* & Xiaoqiang Huang*

Nature2023 https://doi.org/10.1038/s41586-023-06822-x