在生殖细胞发育的过程中，细胞质中存在一种独特的无膜结构，称为生殖细胞颗粒（germ granules）。生殖细胞颗粒作为无膜细胞器，在生殖细胞发育中承担RNA储存、RNA加工、翻译等基因表达调控众多核心功能。2009年，Anthony A. Hyman团队首次在秀丽隐杆线虫胚胎中观察到P颗粒的动态液体行为（如融合、流动），并证明其形成呈现浓度依赖的相分离，和多价相互作用，标志着LLPS正式进入生物学领域。2015 年，Timothy团队利用生殖细胞特异的标志分子DDX4 作为研究模型，在体外应用物理学、化学、生物学等技术手段，全面阐明了内在无序蛋白区域（Intrinsically disordered protein regions, IDRs）介导的多价弱相互作用在哺乳动物细胞内发生相分离的关键作用及机制。
生殖颗粒主要由RNA和蛋白质组成，在配子发生、RNA调控和转座子沉默等关键生物学过程中发挥重要作用。在小鼠的精母细胞，线粒体簇间的Intermitochondrial cement（IMC）是哺乳动物雄性生殖细胞中最广泛表征的生殖颗粒之一，也是PIWI 结合RNA（PIWI interacting RNA, piRNA）加工的中心；在减数分裂后的单倍体圆形精子胞质内，IMC 进一步聚集浓缩转换形成更大的生殖颗粒，称为染色质小体（Chromatoid body, CB）。CB富含RNA代谢相关的蛋白质和RNA分子，是RNA定位、存储与加工的“指挥中心”。这类颗粒通过“液-液相分离（LLPS）”机制组装，类似于细胞内形成的“液滴”结构，对维持RNA稳态和生殖细胞命运至关重要。
DDX4（也称Vasa/Mvh）是生殖细胞颗粒的核心组分，其N端与C端均富含无序结构区（IDRs），是推动颗粒相分离形成的关键。然而，IDRs在体内的功能尚不完全清楚，特别是如何通过IDRs调控颗粒的组装与功能仍缺少体内证据。
近日，中国科学技术大学鲍坚强课题组，联合山东大学刘洪彬课题组，在Cell Death & Differentiation发表题为Combinatorial tagging generates a multi-purpose knock-in mouse model revealing phase separation-dependent germ granules in RNA homeostasis and germline development的研究论文：https://rdcu.be/ei3iN。该研究构建了一种多功能的Ddx4组合标签小鼠模型（Ddx45×HA-P2A-EGFP-T2A-CreERT2）, 通过同源重组技术，在Ddx4基因终止密码子位置定点敲入5×HA-P2A-EGFP-T2A-CreERT2表达框，利用内源性Ddx4启动子驱动携带5×HA修饰的DDX4 (DDX45×HA）、EGFP和CreERT2的表达。通过简单最少步骤的小鼠配繁，实现生殖颗粒的标记、纯化与Cre-LoxP系统的遗传操控及功能解析，并揭示其相分离依赖的RNA代谢调控对精子发生的关键作用。同时团队意外的发现：C端IDR 区连接的HA标签干扰了正常的DDX4功能，导致纯合雄性不育，通过综合应用形态学、细胞生物学及分子生物学技术，发现在DDX4双等位基因携带5×HA标签的雄性不育小鼠：DDX4相分离功能因C端HA标签融合引发的电荷偏移而被破坏，进一步导致CB结构破坏；精子形成后期（圆形精子-> 精子头部变形）严重异常；CB中蛋白与RNA成分显著重构，携带长 3’UTR 的RNA 分子富集能力丧失；粗线期阶段piRNA与转座子相关piRNA生成异常，LINE转座子表达升高；
该研究提供了首个可用于同时追踪生殖颗粒结构、分选生殖细胞/生殖颗粒、并进行功能性遗传操作的三合一小鼠模型，为生殖细胞发育、无膜细胞器研究、RNA(piRNA)调控机制等多个方面提供了强大小鼠工具。此外，该模型可被广泛应用于：精原细胞或精母细胞阶段特异性基因功能研究；生殖颗粒相分离调控功能验证；CB相关疾病模型的建立（如男性不育）；RNA代谢通路的精准调控研究。目前该小鼠模型已分享给国内多个实验室同行（包括中科院西北高原研究所杨其恩教授实验室；上海交通大学吴际教授实验室；西湖大学蒋敏教授实验室，南方医科大学赵小阳教授实验室，四川大学华西医院许文明教授实验室，等）。
本课题得到中科大史庆华教授和何立教授的指导与帮助！中科大附一院/生命医学部已毕业硕士生孟兰，博士生徐曹玲，博士后曹玉珠，生殖遗传中心吴丽敏研究员为论文的共同第一作者。中科大附一院/生命医学部鲍坚强研究员，博士后李文卿与山东大学刘洪彬教授为文章的共同通讯作者！该研究得到了国家重点研发计划、国家自然科学基金、合肥综合性国家科学中心大健康研究院前沿交叉科学与生物医学研究院基金、安徽省自然科学基金等经费的支持！