核酶是具有催化活性的RNA，主要参加RNA的加工与成熟。与蛋白酶类似，核酶也会折叠成高级结构发挥功能，RNA序列在一级序列的基础上形成局部的helix、loop等二级结构元件，再在金属离子的帮助下进一步的折叠形成具有酶活中心的三级结构，在不存在蛋白的情况下发挥催化反应。但由于RNA的异质性和灵活性，使RNA结构的解析受到了很大的挑战，这也限制了对结构和功能间联系的认知。张凯铭团队此前在2021年首次解析了四膜虫核酶全长结构（Nature 2021）以及解析了多个不同构象错误折叠的四膜虫核酶结构（PNAS 2022），为冷冻电镜解析高分辨率RNA结构做出了表率。然而，因为缺少两步剪接反应的中间态结构，对于核酶剪接机制的理解还不够完善。张凯铭课题组在前期基础上进行了第一步剪接反应底物的设计，并通过冷冻电镜解析了四膜虫核酶第一步剪接过程中的四种不同构象，深入剖析了第一步剪接机制。该成果于2023年1月20 日在Nucleic Acids Research杂志在线发表，题为《Snapshots of the first-step self-splicing of Tetrahymena ribozyme revealed by cryo-EM》。

该研究首先在体外验证了设计后的底物可以完成第一步催化反应，并确定了核酶与底物的最优反应条件，然后利用单颗粒冷冻电镜捕获了四膜虫核酶剪接过程中的四种不同构象（图1）。

图1. 冷冻电镜解析四膜虫核酶第一步自剪接过程中的四种不同构象 (Con1-4)

Con1-4分别为未结合底物的apo state、刚结合底物的undocked state、结合底物后进入活性中心的pre-catalysis state以及完成转酯反应的post-catalysis state。通过结构比对，结合底物后，核酶5 ′端的IGS/IGSext形成P1/P1ext双链，其会围绕J1/2发生53 Å的移动将底物带至核酶催化活性中心。P1和催化活性中心内的三个单链片段 (J8/7、J4/5、J5/4) 之间的三级相互作用介导了P1/P1ext双链的正确定位。随后，早已占据活性位点的外源GTP的3′-OH对5′剪接位点进行亲核攻击，完成第一步转酯反应，进而释放催化产物。概况来说，在四膜虫核酶第一步剪接反应的过程中，核酶发挥功能的同时伴随着构象的改变：IGS/IGSext与底物配对形成P1/P1ext双链；P1/P1ext进入活性中心；外源GTP进攻5′剪接位点完成第一步剪接反应（图2）。

 图2．第一步自剪接过程中四膜虫核酶的示意图

P表示碱基配对区域，J表示连接配对区域的单链区域

中国科学技术大学生命科学与医学部的博士一年级研究生张晓静和李珊珊副研究员为本文共同第一作者，中国科学技术大学生命科学与医学部张凯铭教授和李珊珊副研究员为本文的共同通讯作者。本工作中冷冻样品初筛、数据收集与处理在中国科学技术大学冷冻电镜中心完成，该工作也获得了细胞动力学重点实验室的大力支持。研究工作的开展得到了科技部国家重点研发计划、中科大科研启动经费和中科院率先行动引才计划择优经费的资助。

原文链接:https://academic.oup.com/nar/advance-article/doi/10.1093/nar/gkac1268/6993854