环形RNA (Circular RNA, circRNA) 是真核生物转录与转录后加工的自然产物，主要由反向剪接 (backsplicing) 产生，在各种生理条件和人类疾病中行使着重要的调控功能。目前已知的调控环形RNA生成的多种顺式元件和反式因子大都位于或结合环形RNA的侧翼内含子发挥作用。此外，目前环形RNA报告系统均依赖于内含子的功能元件，并与线性剪接偶联，大大限制了内含子独立的调控元件及backsplicing特异调控因子的鉴定。

2024年10月25日，中国科学技术大学生命科学与医学部单革教授和王小林特任副研究员在Molecular Cell在线发表题为“ZC3H14 facilitates backsplicing by binding to exon-intron boundary and 3' UTR”的研究论文，鉴定了调控环形RNA生成的蛋白ZC3H14，并揭示了该蛋白结合环形RNA成环外显子的外显子-内含子边界序列及同源基因的3' UTR，促进环形RNA生成的分子机制。

图1. ZC3H14调控环形RNA生成的分子机制及与雄性不育的相关性

研究人员基于无内含子基因来源的环形RNA构建了circGFP报告系统并进行CRISPR-Cas9全基因组敲除筛选，鉴定出ZC3H14蛋白作为环形RNA生成的正调控因子。通过在HEK293细胞中对ZC3H14蛋白进行敲低、过表达以及敲除并进行高通量测序分析，该研究发现ZC3H14促进约40%的环形RNA的生成，且对mRNA表达与可变剪接没有显著影响。此外，ZC3H14蛋白在真核生物中高度保守，该研究还发现其同源蛋白Nab2的敲除显著抑制裂殖酵母中环形RNA的产生。

结合ZC3H14 iCLIP-seq分析，研究人员发现ZC3H14蛋白结合环形RNA成环外显子两侧的外显子-内含子边界 (Exon-intron boundary, EIB) 及同源基因3' UTR序列促进环形RNA产生，ZC3H14结合的EIB突变或3' UTR缺失均造成环形RNA的表达水平下降，ZC3H14与3' UTR的结合能够增强或稳定其与EIB的结合。单独或联合使用ZC3H14结合EIB或3' UTR 作为顺式元件能够用于环形RNA表达载体的构建，实现环形RNA不同程度的过表达。

通过免疫共沉淀和质谱分析，该研究发现ZC3H14蛋白能够结合多种剪接体组分，包括U1、U2及U4/U6.U5 snRNP组分，促进环形RNA产生。进一步的双分子荧光互补及荧光免疫共沉淀实验表明ZC3H14蛋白可以二聚化甚至寡聚化。并且ZC3H14的锌指结构域在其与剪切体互作、二聚化及与RNA的结合中发挥着关键作用。

研究人员发现ZC3H14蛋白在人类与小鼠睾丸组织中表达最为显著。ZC3H14敲除雄性小鼠后代减少、睾丸减小、精子数目减少且异常精子比例升高，同时睾丸中环形RNA表达水平下降。ZC3H14主要表达在粗线期、双线期精母细胞与圆形精细胞，ZC3H14敲除影响正常减数分裂进程，造成粗线期及双线期联会复合物侧轴断裂，同时伴随粗线期精母细胞环形RNA表达水平降低。在小鼠生殖细胞中，ZC3H14同样结合成环外显子的EIB与同源基因的3' UTR。此外，ZC3H14及环形RNA与人类非梗阻性无精症显著相关，与正常睾丸组织相比，非梗阻性无精症患者睾丸中ZC3H14及环形RNA的表达水平显著降低。

综上，该研究鉴定了一个真核生物中保守的反向剪接调控因子ZC3H14，该蛋白通过与剪接体相互作用、二聚化并结合成环序列外显子-内含子边界和3' UTR促进环形RNA产生，ZC3H14及环形RNA的表达与雄性不育存在紧密联系。

我校生命科学与医学部博士生李奇奇、杨刚为该论文共同第一作者，生医部王小林特任副研究员、单革教授为该论文共同通讯作者。该研究的合作者包括中国科学技术大学史庆华教授和中国科大附属第一医院唐丽琴主任，该研究得到了基金委、科技部项目的支持。

文章链接：https://doi.org/10.1016/j.molcel.2024.10.001